摘要：

氣候變化和人類活動導(dǎo)致凋落物和根系投入物的質(zhì)量和數(shù)量發(fā)生變化，可影響森林生態(tài)系統(tǒng)中的地下生物地球化學(xué)過程。然而，地上凋落物和根系投入是否以及在多大程度上影響土壤微生物代謝和養(yǎng)分限制機制尚不清楚。本研究通過4年的田間操作試驗，設(shè)置對照（CK）、雙凋落物輸入（DL）、無凋落物（NL）、無根系（NR）和無投入（NI）處理，分析0-10 cm和10-20 cm土壤胞外酶活性和化學(xué)計量比特征，探討微生物代謝限制，闡明制約養(yǎng)分限制的主要驅(qū)動因素。結(jié)果表明：DL處理與C循環(huán)相關(guān)的酶（β-1,4-葡萄糖苷酶（BG）、纖維素二糖水解酶（CBH））和N循環(huán)相關(guān)的酶（β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP））活性顯著高于NR處理；此外，與其他處理相比，磷循環(huán)相關(guān)的酶活性（酸性磷酸酶（AP））顯著升高，在NR處理下活性最高。此外，不同碳輸入對土壤微生物代謝限制沒有顯著影響，沒有改變原有的養(yǎng)分限制格局。微生物養(yǎng)分代謝限制的主要驅(qū)動因素包括土壤理化性質(zhì)、土壤全量養(yǎng)分和速效養(yǎng)分，其中土壤水分和pH對微生物C限制的影響最大，土壤全量養(yǎng)分對微生物N限制的影響最大。土壤碳輸入的變化通過影響土壤理化性質(zhì)、總養(yǎng)分等改變了土壤胞外酶活性及其化學(xué)計量比。本研究為認識環(huán)境變化下森林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)提供了數(shù)據(jù)依據(jù)。

研究背景：

森林作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對全球氣候變化的響應(yīng)非常敏感。環(huán)境變化（如全球變暖、降水增加和干旱）和人為干擾（如森林間伐和凋落物采伐）可顯著影響森林的凈初級生產(chǎn)力，從而改變土壤中凋落物和根系的數(shù)量和質(zhì)量。森林土壤碳輸入的變化影響全球碳和氣候變化以及植被格局，尤其是地下生態(tài)過程中的養(yǎng)分循環(huán)。土壤微生物在地下生態(tài)過程中起著非常積極的作用。土壤胞外酶活性作為微生物養(yǎng)分需求和代謝過程的指標，可以用來描述微生物能量、養(yǎng)分需求以及土壤碳（C）、氮（N）和磷（P）的吸收和利用的變化，土壤酶化學(xué)計量比可用于確定微生物在能量和養(yǎng)分獲取過程（如C、N、P）中的資源分配。因此，探索森林土壤胞外酶活性和化學(xué)計量比對凋落物和根系輸入和分解的響應(yīng)動態(tài)，有助于準確評估森林土壤地下生態(tài)過程對環(huán)境變化的響應(yīng)。

土壤胞外酶介導(dǎo)有機質(zhì)周轉(zhuǎn)和養(yǎng)分循環(huán)，受凋落物、根系等外源有機質(zhì)輸入的影響，其影響程度與外源輸入物質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量有關(guān)。以往的研究表明，土壤胞外酶活性對外源有機質(zhì)的輸入有不同的響應(yīng)。例如，在雙重凋落物處理下，亞熱帶針葉林的纖維素酶活性顯著增加。雙重凋落物可以為微生物提供豐富的底物，從而促進微生物的生長和活性。研究發(fā)現(xiàn)，去除凋落物會顯著降低纖維素酶活性，主要是由于凋落物去除處理導(dǎo)致土壤活性有機碳減少。研究還發(fā)現(xiàn)，熱帶森林土壤在減少凋落物輸入后，會增加磷限制和與磷循環(huán)相關(guān)的酶活性。這些研究表明，凋落物對土壤胞外酶活性的影響是一個復(fù)雜的過程，受多因素調(diào)控。此外，根系分泌物是土壤酶的重要來源，而刈割處理通常會導(dǎo)致土壤有機碳含量降低，從而影響土壤酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，秋季亞熱帶森林采根顯著降低了β-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶的活性。這些結(jié)果突出了對碳輸入變化背景下土壤胞外酶活性調(diào)節(jié)的不確定性。因此，需要進一步研究凋落物和根系分泌物的輸入對土壤酶活性和養(yǎng)分限制的影響。    

土壤胞外酶化學(xué)計量學(xué)（EES）通常用于評價以C、N和P為代表的微生物代謝特征。這些土壤胞外酶通常被分類為“C獲取”（如纖維素酶和葡萄糖苷酶）、“N獲取”（如β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶）和“P獲取酶”（如磷酸酶），可以反映土壤養(yǎng)分資源的有效性和微生物對養(yǎng)分需求的變化。凋落物的質(zhì)量和數(shù)量可以改變森林土壤的養(yǎng)分狀況，微生物通過調(diào)節(jié)土壤胞外酶化學(xué)計量來調(diào)節(jié)其生長對養(yǎng)分的利用。多項研究表明，土壤胞外酶活性化學(xué)計量比在凋落物添加后呈現(xiàn)凋落物去除率顯著增加和凋落物去除率顯著降低的趨勢。研究主要集中在闊葉和落葉的熱帶和亞熱帶樹種，它們的凋落物組成與針葉林不同。溫帶針葉林是否也有類似的反應(yīng)模式？同時，植物根系釋放出大量的有效養(yǎng)分，促進對養(yǎng)分短缺作出反應(yīng)的微生物分泌胞外酶。這說明，不同地區(qū)凋落物和根系輸入方式對森林土壤微生物代謝的影響存在不確定性。土壤胞外酶化學(xué)計量能反映土壤微生物群落對養(yǎng)分的需求和利用能力，與土壤養(yǎng)分循環(huán)、轉(zhuǎn)化及其有效性相關(guān)，可用于衡量土壤微生物能量和養(yǎng)分資源的有限性。Moorhead等（2016）提出了繪制C:N和C:P獲取酶活性的矢量圖“長度”和“角度”，以說明微生物代謝特征。然而，在大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)中，對C的需求增長速度快于對N或P的需求，應(yīng)用該方法可以幫助我們識別微生物代謝的局限性，為高寒森林生態(tài)系統(tǒng)土壤養(yǎng)分有效性和微生物養(yǎng)分限制的評價提供基礎(chǔ)和擴展應(yīng)用。

天山山脈是歐亞大陸腹地最大的山系。雪山云杉是天山地區(qū)最具優(yōu)勢的地帶性森林植被，在固氮釋氧、調(diào)節(jié)氣候、保護生物多樣性、維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。該物種凋落物質(zhì)量相對較低（C/N較高），根系較淺，凋落物輸入和根系影響地下土壤微生物的營養(yǎng)限制尚不清楚。因此，本研究進行了為期4年的田間試驗，探索該系統(tǒng)如何通過控制根系和植物殘留物（DIRT）的輸入來影響土壤微生物養(yǎng)分限制。提出了以下問題：（1）凋落物和根系哪種輸入方式對土壤胞外酶的化學(xué)計量影響更大？（2）凋落物加減和斷根處理是否會改變原有土壤微生物養(yǎng)分限制格局？（3）不同外源碳輸入處理下土壤微生物代謝營養(yǎng)限制變化的主要驅(qū)動因素是什么?

材料與方法：

2017年9月，在云杉（Picea schrenkiana）森林中選取3個代表性樣地，樣地面積為50 m × 50 m，樣地間距 >100 m。每個樣地隨機設(shè)置5個1 m × 1 m樣地，共15個樣地（3個樣地× 5個處理）。試驗處理如下，對照（CK）：不作特殊處理，維持地上、地下正常投入。雙凋落物（DL）：每月清除凋落物處理收集的凋落物均勻分布于小區(qū)內(nèi)。無凋落物（NL）：第一步是在地塊上方0.5米處放置一個100目尼龍網(wǎng)來收集凋落物。在此之后，每個月都會對小區(qū)內(nèi)收集的地表凋落物和植被進行清理，以確保清潔和無殘留物的環(huán)境。無根（NR）：采用挖溝法排除根。沿著地塊的四周挖了1米深的壕溝。根被切除并插入三層尼龍網(wǎng)，網(wǎng)目大小為100，防止根生長到地塊。無投入（NI）：該處理結(jié)合了根排除和凋落物清除兩種處理（圖1）。    

經(jīng)過研究四年的試驗控制，于2021年10月使用土鉆在垂直方向上收集土壤樣本，深度為0-10厘米和10-20厘米。然后將樣品密封在袋子中，去除植物根、動物和植物殘留物以及其他雜質(zhì)。測定土壤胞外酶活性和微生物生物量碳、氮、磷，以及土壤的物理化學(xué)性質(zhì)。

圖1 本研究地點及實驗處理。

主要研究結(jié)果：

1、不同碳輸入條件下土壤胞外酶的化學(xué)計量學(xué)特征

4年定位試驗后，不同碳輸入處理土壤胞外酶活性和化學(xué)計量比存在顯著差異（圖2）。各土層中β-1,4-葡萄糖苷酶（BG）、纖維素二糖水解酶（CBH）和β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性以DL處理最高，且DL處理顯著高于NL處理（P < 0.05）；NR處理活性最低，且各值均顯著低于CK處理。各土層亮氨酸氨基肽酶（LAP）活性均以DL處理最高，且顯著高于NL處理（P < 0.05）；NI處理的LAP活性最低，顯著低于其他處理。NR處理各土層酸性磷酸酶（AP）活性顯著高于其他處理（P < 0.05）。在各土層中，NR處理的EC:N、EC:P和EN:P最低。各土層中，NL處理的EC:P和EN:P最高，顯著高于NR和NI處理（P < 0.05）。   

圖2 土壤胞外酶活性及其化學(xué)計量學(xué)特征

2、不同碳輸入條件下土壤胞外酶化學(xué)計量的載體特征

不同碳輸入處理和土層的土壤酶化學(xué)計量載體特征不同（圖3）。所有點均在虛線下方（1:1線），表明土壤微生物群落具有很強的N限制。碳輸入和土層對微生物代謝特征有顯著的主交互作用（P < 0.01）。不同土層處理的載體長度（0.234-0.950）和角度（13.932°-28.395°）存在差異（P < 0.05），NL處理各土層下的載體長度（微生物C限制）最長，加劇了C限制，NR處理的載體長度最短，受C限制的影響最小。NI處理下各土層的載體角度（微生物N限制）最大，減緩了土壤微生物群落的N限制?；冢˙G + CBH）/（NAG + LAP）和（BG + CBH）/AP比值關(guān)系，確定了CK、DL、NR、NL和NI處理在不同的碳輸入處理中表現(xiàn)出總體的N限制。   

圖3 胞外酶化學(xué)計量學(xué)的C-N獲取與C-P獲取的相對比例（a），載體長度和角度的變化（b和c），以及它們之間的關(guān)系（d）。

3、酶活性和化學(xué)計量學(xué)與土壤性質(zhì)和微生物生物量的相關(guān)性分析

土壤基本指標SWC（67.4%）、DOC（6.3%）和NH4+-N（5.2%）的箭頭線最長，說明與其他因子相比，這3個理化因子更能解釋土壤酶活性及其化學(xué)計量比的變化（圖4）。BG、CBH、NAG、LAP、EC:N、EC:P與SWC、SOC、TN、TP及其比值相關(guān)。DOC、NH4+-N、NO3?-N在同一方向呈小角度長線正相關(guān)，在pH箭頭相反方向呈負相關(guān)。AP活性與土壤pH呈正相關(guān)。在土壤微生物指標中，土壤MBP（45.5%）和CUE（11.2%）很好地解釋了土壤酶活性及其化學(xué)計量比的變化（圖4）。如CBH、NAG、LAP、EC:N與MBC、MBN、MBP、MBC:MBP、MBN:MBP呈極顯著正相關(guān)。而與CUE、MBC:MBN呈負相關(guān)。AP與CUE、MBC: MBP呈正相關(guān)。載體長度與SWC、SOC、TN、SOC:TN、SOC:TP和NH4+-N呈極顯著正相關(guān)（P < 0.01），與TP和TN:TP呈顯著正相關(guān)（P < 0.05）（圖5）；矢量角度（N vs. P獲?。┡cpH和TP呈正相關(guān)，但相關(guān)性不強。載體長度與MBC: MBN和CUE呈顯著正相關(guān)（P < 0.05）。   

圖4 土壤胞外酶及其化學(xué)計量比與土壤性質(zhì)和微生物生物量的冗余分析

圖5 矢量長度和矢量角度與土壤特性和微生物生物量的相關(guān)性

4、土壤性質(zhì)和微生物量對微生物代謝碳氮限制的影響

PLS-PM分析確定了土壤理化性質(zhì)、總養(yǎng)分含量、養(yǎng)分比值、速效養(yǎng)分含量、微生物生物量、微生物生物量比和CUE對微生物C和N限制的直接和間接影響（圖6）。土壤總養(yǎng)分含量（0.576）、養(yǎng)分比值（0.162）和速效養(yǎng)分含量（0.157）對微生物C限制有正向影響，其中總養(yǎng)分含量的直接影響最大（0.576），其次是土壤理化性質(zhì)的負總影響最大（- 0.645）。此外，土壤理化性質(zhì)（0.580）、總養(yǎng)分含量（1.785）和微生物生物量（1.112）對微生物N限制有正向影響，其中總養(yǎng)分含量（1.334）對微生物N限制有很強的正向總影響，速效養(yǎng)分含量（- 0.895）對微生物N限制有較大的直接負影響和總影響。   

圖6 利用偏最小二乘路徑模型（PLS-PM）分析了影響微生物C和N代謝限制的可能途徑

    結(jié)論：

結(jié)果表明：不同碳輸入和不同土層對干旱半干旱森林生態(tài)系統(tǒng)土壤活性、土壤理化性質(zhì)及微生物養(yǎng)分限制有顯著影響。土壤碳輸入模式的變化導(dǎo)致土壤有機質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量的差異，從而對土壤C、N循環(huán)相關(guān)酶活性產(chǎn)生總體影響，雙凋落物處理（DL）顯著高于無投入（NI）和無根處理（NR），但N循環(huán)相關(guān)LAP酶活性在不同土層下在無投入（NI）處理中最低。有趣的是，P循環(huán)相關(guān)酶的活性與C、N循環(huán)相關(guān)酶的活性相反，說明離體根系的活性顯著高于其他處理，這是因為低濃度的N可以刺激森林土壤微生物加速磷酸酶的分泌，提高磷酸酶的活性。不同碳輸入對土壤微生物代謝限制沒有顯著影響，沒有改變原有的養(yǎng)分限制格局。微生物養(yǎng)分代謝限制的主要驅(qū)動因素包括土壤理化性質(zhì)、土壤總養(yǎng)分含量和速效養(yǎng)分，其中土壤SWC和pH對微生物C限制影響最大，土壤總養(yǎng)分含量對微生物N限制影響最大?？傮w而言，微生物代謝限制反映了森林生態(tài)系統(tǒng)微生物對土壤環(huán)境變化的響應(yīng)策略。本研究為評估外源有機質(zhì)輸入改變條件下溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)碳、氮、磷和養(yǎng)分循環(huán)過程的動態(tài)提供了基礎(chǔ)，有助于理解全球環(huán)境變化對土壤生物地球化學(xué)循環(huán)過程的影響。